背景
帕金森病
（
PD
）
患者以運動缺陷為主要臨床表現，如運動遲緩和靜止性震顫等，目前尚沒有能夠減緩帕金森病進展的改良療法。
NLRP3
炎性小體
屬於核苷酸結合結構域
（NBD）
和富含亮氨酸重複序列
（LRR）
的蛋白質家族
，
是先天免疫系統的主要組成部分
。由胞質模式識別受體
NLRP3
、銜接蛋白
ASC
和
Caspase-1
（Casp1）
組成的蛋白複合物。
已明確
小膠質細胞
NLRP3
炎性小體過度活化會導致
PD
非細菌性炎症反應，但在神經退行性疾病中神經元炎性小體啟用的病理機制尚未闡明。
2
022
年
5
月
2
5
日，美國
約翰霍普金斯大學醫學院
的
Panicker
等研究人員在
Neuron
雜誌發表了題為
“
Neuronal NLRP3 is a Parkin substrate that drives neurodegeneration in Parkinson‘s disease
”
的研究論文。
該研究發現
在小
鼠和人多巴胺（
DA
）
神經元中，
E3
泛素連線酶
Parkin
活性喪失
引起
神經元自發性
NLRP3
炎性小體組裝，導致
DA
神經元死亡。
Parkin
透過泛素化和靶向
NLRP3
蛋白酶體降解來抑制炎性小體的啟動。
Parkin
活性喪失
有助於
另一種泛素化底物
ZNF746/PARIS
的積累
，並
產生線粒體活性氧
（MitoROS）
，從而啟用
NLRP3
炎性小體複合物組裝。
結果
一、Parkin耗竭後DA神經元內NLRP3炎性小體啟用導致DA神經元的丟失
1。Parkin
耗竭後
DA
神經元內
NLRP3
炎性小體被啟用
首先，
研究者將
AAV GFP-Cre
透過立體定位方式注射到
Parkin
flx/flx
小鼠的黑質緻密部（
SNpc
）建立成年發病模型，即造成
DA
神經元特異性
Parkin
耗竭。
為評估炎性小體的啟動和啟用，研究人員做了免疫印跡與免疫組織化學實驗，結果顯示，相比於
AAV GFP
對照組，
AAV GFP-Cre
注射組
Parkin
不表達，而
NLRP3
和裂解的半胱天冬酶
1
（
Casp1
）水平均增加（圖
1B
）。免疫組織化學
（IHC）
結果顯示
Parkin
耗竭導致
DA
神經元中
Casp1
活性顯著上調以及炎性小體組裝的標誌物
ASC
斑點的形成（圖
1D
），而小膠質細胞無此改變（圖
1C
），表明
Parkin
耗竭的神經元中
NLRP3
炎性小體自發啟用。
為驗證
DA
神經元
Parkin
缺失自發地引起細胞炎性小體啟用，研究人員透過
Casp
熒光抑制劑
（FLICA）
染色以評估
Casp1
活性。在小鼠的飼料中加入口服腦滲透劑
PLX5622
以消耗小膠質細胞後，再對成年發病型
DA
神經元的
Parkin
進行耗竭。相比於同窩對照組，治療組
DA
神經元中
NLRP3
和裂解的
Casp1
水平沒有變化（圖
1F
，
G
），
表明小膠質細胞不影響炎性小體啟用
。
免疫印跡分析顯示，與同基因對照
（iCont）
人類
DA （hDA）
神經元相比，
Parkin
缺陷型
hDA
神經元中
NLRP3
和裂解的
Casp1
水平增加（圖
1H
）。辛二酸二琥珀醯亞胺
（DSS）
交聯試驗顯示
Parkin
缺陷型
hDA
神經元
ASC
寡聚化增加。此外，
FLICA
染色測得
Casp1
活性增加（圖
1J
），
表明
NLRP3
炎性小體被啟用組裝成複合體
（
圖
1I）
。
圖1。 多巴胺（DA）神經元特異性Parkin缺失引起NLRP3 炎性小體自發啟用。
2。
成人型
DA
神經元內
NLRP3
炎性小體啟用足以導致
DA
神經元的丟失
為評估
DA
神經元中
NLRP3
炎性小體啟用的影響，將
AAV GFP
或
AAV GFP-cre
立體定向注射到
8-10
周齡
NLRP3
A350VneoR
小鼠
SNpc
兩側（在
cre-
重組酶表達細胞中表達
muckle- well
相關
A350V
突變
NLRP3
基因），
3
個月後取中腦黑質進行
I
HC
，結果表明
TH
表達的多巴胺能神經元約為
80%GFP
陽性，而
Iba-1
陽性的小膠質細胞中
GFP
訊號較少
（
圖
2B
和
2C）
。
免疫印跡分析顯示，與
AAV GFP
注射側相比，
AAV GFP-Cre
注射側裂解的
Casp1
增加
（
圖
2D）
。此外，
TH
和
Nissl
染色顯示
AA
V GFP- cre
側
DA
神經元受損
（
圖
2E
和
2F）
。這些結果表明，
細胞自發性
NLRP3
炎性小體啟用足以驅動
DA
神經元死亡。
圖2。SNpc DA神經元特異性NLRP3炎性小體啟用足以驅動DA神經元死亡
二、預防炎性小體啟用可防止Parkin相關的神經元退行性變
3。
Parkin
使神經元
NLRP
多泛素化有助於蛋白酶體清除
為評估
Parkin
和
NLRP3
蛋白是否相互作用，研究者進行
GST pull-down
實驗發現
GST
標記的
Parkin
可以下調重組
NLRP3
蛋白，表明兩種蛋白直接相互作用
（
圖
3A）
。在
WT
小鼠腦裂解物中
Parkin
與
NLRP3
發生共免疫沉澱，而
Parkin
-
/
-
或
NLRP3
-
/
-
小鼠無此現象
（
圖
3
B
）
。在
SH-SY5Y
細胞內泛素化實驗證明，
Flag
標記的
NLRP3
可以被
myc
標記的
Parkin
泛素化，同時
Flag
訊號呈拖尾現象，進一步證明
Parkin
介導
NLRP3
多泛素化修飾（圖
3C
）。
通常
Parkin
保持自抑制構象，需要
PINK1
激酶才發揮功能。研究人員透過構建缺乏
E3
泛素連線酶活性的
C431S Parkin
或引入一種突變（所有賴氨酸殘基突變為精氨酸）
HA
，使
Par
kin
不能摻入多聚泛素鏈中，從而阻止
Parkin
介導的
NLRP3
泛素化。人類
PINK1
顯示低激酶活性
，
而鞘翅目昆蟲赤擬谷盜
PINK1 （Tribolium castaneum PINK1， Tc PINK1）
具有良好的激酶活性，可用於體外激酶實驗。
體外泛素化實驗表明，
TcPINK1
啟用
WT Parkin
從而使
NLRP3
蛋白泛素化。
Parkin
自身泛素化以及
NLRP3
泛素化被非活性
TcPINK1
或突變
C431S Parkin
阻斷（圖
3D
）。
透過串聯泛素結合實體
（TUBE）pull-down
實驗，在
iCont
組中檢測到
NLRP3
訊號，但在
Parkin
缺陷型
hDA
神經元中無訊號，表明
DA
神經元
NLRP3
是一種
Parkin
多泛素化底物（圖
3E
和
3F
）。
為證明
Parkin
介導
NLRP3
多泛素化導致其降解，研究者使用了放線菌酮
（CHX）
追蹤分析。在
Flag-NLRP3
和
myc
標記的
WT Parkin
共轉染的
SH-SY5Y
細胞中，
Flag-NLRP3
的半衰期顯著降低，而
myc-C431S Parkin
的過表達延長了
Flag-NLRP3
的半衰期（圖
3G
）。
此外，在
iCont
和
Parkin
缺陷的
hDA
神經元中進行
CHX
追蹤分析，發現
Parkin
缺陷時
NLRP3
的半衰期明顯延長。
WT-Parkin
介導的
Flag-NLRP3
清除可以在用蛋白酶體抑制劑
MG-132
預處理後被逆轉（圖
S3H
），表明
Parkin
透過蛋白酶體介導
NLRP3
的清除。總之，
這些結果表明
DA
神經元
Parkin
在
NBD
結構域內泛素化
NLRP3
，靶向它進行蛋白酶體降解
。
圖3。NLRP3是Parkin多泛素化的底物
4。
與
Parkin
相互作用
的
底物
ZNF746 （PARIS）
透過
增加
mitoROS
促進
NLRP3
炎性
小
體
組裝
先前研究表明，
PARIS
介導的線粒體生物合成抑制，導致
Parkin
缺乏時發生線粒體缺陷。為了評估
PARIS
在
DA
神經元炎性小體啟用中的作用，研究者將
AAV shRNA-
PARIS
（或
AAV con-shRNA
）與
AAV GFP-Cre
起注入
Parkin
flx/flx
小鼠，以防止
Parkin
缺失後
PARIS
啟用，圖
4A
）。
FLICA
分析以及
TH
/Iba
-1
染色顯示，聯合注射
AAV GFP-Cre
和
AAV shRNA-
PARIS
的小鼠
DA
神經元
Casp1
活性顯著降低
（
圖
4B）
。免疫印跡資料也證實了上述小鼠腦裂解物中
Casp1
和
Gasdermin-D
水平顯著下降
（
圖
4C）
，而單獨注射
AAV GFP-Cre
或
AAV shRNA-
PARIS
組中
NLRP3
活性無明顯變化，這表明
DA
神經元炎性小體的啟動和啟用是獨立的過程
（
圖
4C）
。
為評估（
CRISPR/ cas9
介導的）
P
ARIS
基因敲除
hDA
神經元中，
NLRP3
炎症體的啟動和啟用，採用
DSS
交聯法和免疫印跡法檢測，研究者發現在
Parkin
缺陷的
hDA
神經元中，
ASC
寡聚以及
Casp1
和
Gasdermin-D
裂解水平顯著降低，
NLRP3
活性無顯著改變
（
圖
4D）
。
FLICA
染色驗證了降低
PARIS
水平阻止了
Parkin
缺陷的
h
DA
神經元的
C
asp
1
啟用
（
圖
4
E
）
。這些結果表明，
在
Parkin
基因敲除的
DA
神經元中，
NLRP3
炎性小體啟用的第二步需要
PARIS
。
圖4。PARIS促進炎性小體在Parkin耗盡的DA神經元中的啟用
5。
預防炎性小體啟用可
防止Parkin相關的神經元退行性變
為
確定
NLRP3
是在
Parkin
缺失時驅動
DA
神經元
Casp1
啟用的主要炎性小體感測器。將
AAV NLRP3-shRNA（
或非靶向
AAV
對照
shRNA）
和
AAV GFP-Cre
一起引入
Parkin
flx
/
flx
小鼠，以防止
Parkin
缺失後
NLRP3
啟用。免疫印跡分析
（
圖
5A）
和
FLICA
染色實驗，發現在體內敲除
NLRP3
完全抑制了
Casp1
的啟用。免疫印跡和
IHC
證實了在
DA
神經元（而不是小膠質細胞）中
NLRP3
敲低
（
圖
5A）
。透過
TH/Nissl
染色和體視學分析評估，
NLRP3
降低可防止成年發病型
Parkin
缺失介導的
DA
神經元丟失
（
圖
5B
和
5C）
。
此外，與同窩對照
Parkin
flx/flx
/Casp1
+/+
小鼠相比，成人發病型
Parkin
耗盡的
Parkin
flx/flx
/Casp1
-/-
小鼠存在顯著增加的
TH
陽性
DA
神經元，提示敲除
Casp1
具有神經保護作用
（
圖
5D
和
5E）
。
IHC
和
PI
染色結果顯示，
Casp1
基因敲除可阻止
Parkin
缺陷型
h
DA
神經元
TH
表達減少和細胞死亡
（
圖
5F-5I）
。
圖5。阻止炎性小體啟用可以防止Parkin相關神經元死亡
三、在α-Syn PFF模型中，Parkin活性喪失導致DA神經元NLRP3炎性小體依賴性神經退行性變
6。
在
α-Syn PFF
模型中，
Parkin
活
性丟失啟用
DA
神經元
NLRP3
炎性
小
體
將預先形成的α突觸核蛋白原纖維（α
-Syn PFF
）注射到小鼠紋狀體建立散發性帕金森病模型。注射
α-Syn PFF
後，
Parkin
被滅活從而導致
Parkin
底物積累和線粒體缺陷。
在
α-Syn PFF
模型中
，免疫印跡分析顯示
NLRP3
和裂解的
Casp1
顯著上調，表明伴隨
Parkin
活性降低，
NLRP3
炎性小體啟動和啟用
（
圖
6B）
。
FLICA
分析以及對
TH
和
p-S129
a
-Syn
進行雙重免疫染色發現，在注射α
-Syn PFF
小鼠的
DA
神經元中，
Casp1
活性和病理性α
-Syn
的標誌物
p-S129
α
-Syn
免疫染色顯著增加
（
圖
6C）
。
IMARIS
重建共聚焦影象顯示，在注射
α-Syn PFF
的小鼠
TH
陽性
DA
神經元內，
p-S129
α
-Syn
和
Casp1
活性均增加
（
圖
6D）
。
因觀察到
PARIS
積累驅動線粒體缺陷，研究者透過免疫印跡檢測裂解的
Casp1
水平
（
圖
6E）
，以及
FLICA
分析來評估
α-Syn PFF
注射的
WT
和
PARIS
缺陷小鼠的
DA
神經元中炎性小體啟用
（
圖
6F）
。
上述兩種方法的實驗結果都表明，在小鼠
α-Syn PFF
模型中，
DA
能神經元的炎性小體啟用需要
PARIS
。
圖6。在α-Syn PFF模型中，Parkin活性喪失導致DA神經元NLRP3炎性小體依賴性神經退行性變
7。
在
α-Syn PFF
模型中，
Casp1
-/-
小鼠
的
DA
神經元
未發生退行性改變
為探討神經元炎性小體啟用是否參與了α-Syn引起的DA神經元病理性變性，將α-Syn、PFF和PBS立體定向注射到Casp1
+/+
和Casp1
-/-
小鼠的背側紋狀體。6個月後，TH和Nissl染色並計數發現，與Casp1
+/+
小鼠相比，α-Syn PFF注射Casp1
-/-
組TH和Nissl陽性細胞明顯增加（圖6G和6H）。爬杆實驗和握力測試顯示，α-Syn PFF注射的Casp1
-/-
小鼠保持前肢和全肢力量，無運動缺陷（圖6I和J）。免疫印跡分析顯示，注射α-Syn PFF的Casp1
-/-
小鼠紋狀體中TH表達顯著改善，Triton X不溶性部分的寡聚體α-Syn的積累減少和p-S129
α-Syn水平降低（圖6K）
。
這些結果表明，
病理性α-Syn引起Parkin失活，促進神經元NLRP3炎性小體的啟動和啟用，這種啟用依賴於PARIS，並且啟用的Casp-1參與了DA神經元的退變。
8。
死後
PD
患者
DA
神經元中
NLRP3
炎性
小
體
啟用
對死後PD患者和年齡相匹配的對照組中新鮮冷凍的腦
SNpc
分析顯示，PD患者Parkin自泛素化減少，NLRP3、PARIS和裂解的Casp1水平顯著上調（圖7A）。免疫組化顯示，
SNpc
中存活的TH神經元中NLRP3的水平顯著升高（圖7B）。FLICA分析以及I
HC
結果顯示，P
D
患者DA神經元Casp1活性上調，ASC斑點的形成增加（圖7C）。此外，還觀察到
SNpc
中非DA細胞ASC斑點陽性（如圖7D）。
圖7。死後PD患者DA神經元的NLRP3炎性小體啟用
該研究為帕金森病多巴胺神經元中
NLRP3
炎性小體啟動和啟用機制提供了新證據，
Parkin
的缺失透過上調
PARIS
啟用
多巴胺
神經元中的
NLRP3
炎性小體
的
組裝和
Casp1
的啟用，
從而發生
DA
神經元
退行性改變
。其他因素，
如蛋白穩態失衡或改變
Parkin
底物也可能干擾並促進神經元
NLRP3
炎性小體的啟動和啟用。
因此
，阻止神經元
NLRP3
炎性小體啟用的策略
有望成為
PD
和其他神經退行性疾病中
針對
細胞自主
死亡機制進行疾病修飾治療的重要途徑。
參考文獻
Panicker， Nikhil et al。 “Neuronal NLRP3 is a parkin substrate that drives neurodegeneration in Parkinson’s disease。”
Neuron
， S0896-6273（22）00450-0。 25 May。 2022， doi：10。1016/j。neuron。2022。05。009
編譯作者： 香蕉牛奶 （Brainnews創作團隊）
校審： 胖兔子可可 （Brainnews編輯部）