古人云：“橘生淮南則為橘，生於淮北則為枳”“龍生九子，子子不同”，說明即使基因相同，但非DNA序列的變化也會導致遺傳性狀的改變，這就是表觀遺傳修飾在“起作用”。隨著測序成本的不斷降低以及測序技術的更新迭代，對錶觀遺傳學研究逐步深入，表觀組學在科學研究尤其是臨床研究中發揮著越來越重要的作用。
今天給大家分享的就是一篇使用oxBS-seq技術對複雜疾病預後相關的潛在表觀遺傳標誌物研究，該研究成果剛剛發表在Clinical & Translational Medicine期刊上。首先，先了解下oxBS-seq的技術原理和優勢。
oxBS-Seq技術原理
傳統的重亞硫酸鹽測序並不能區分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC），而oxBS-Seq將5hmC氧化5fC，後者可以被Bisulfite轉為U，從而實現5mC的精準檢測；同時，經過與常規Bisulfite結果比較可以實現對5hmC的準確檢測。該技術不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結合同時單鹼基解析度精確檢測DNA羥甲基化。該方法非常適合用於需要對DNA甲基化和羥甲基化進行區分的研究測序分析。
標題：An epigenomic landscape of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer using single-base resolution methylome and hydroxymethylome（使用oxBS-seq方法對宮頸上皮內瘤變和宮頸癌的表觀遺傳學研究）
主要結論：系統的描繪了從宮頸上皮內瘤變（CIN）進展為宮頸癌（CC）的甲基化和羥甲基化圖譜，揭示了8個與CC預後相關的DNA甲基化/羥甲基化差異化基因，可以作為CC預後的表觀遺傳標誌物。
發表時間：2021年7月19日
期刊：Clinical & Translational Medicine
影響因子：11。492
技術方法：WGBS-seq、oxWGBS-seq、RNA-seq。
研究背景:
宮頸癌（CC）作為最常見的婦科腫瘤之一，發病率和死亡率居高不下。早期CC的5年生存率在90%以上，而晚期和轉移性CC的5年生存率則明顯下降。因此迫切需要進一步研究CC的發病機制，尋找潛在的生物標誌物，研究和開發新的診斷技術和治療方法。
有許多研究表明宮頸癌的發生和進展跟異常的表觀遺傳修飾相關，主要包括胞嘧啶甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC），透過5mC/5hmC對基因表達的表觀遺傳調控在腫瘤發生過程中起著關鍵作用。然而這些研究沒有繪製完整的表觀基因圖譜，不能從健康宮頸到宮頸上皮內瘤變（CIN）再到宮頸癌（CC）整個發病機制中區分5mC和5hmC。另外透過多組學綜合分析在宮頸癌中鑑定生物標誌物的報道數量十分有限。
本文作者選擇從健康宮頸到CIN到CC的一系列樣本，進行全基因組亞硫酸氫鹽測序 （WGBS-seq）、oxWGBS-seq、RNA-seq 和組蛋白修飾資料進行綜合分析，以確定CC特異性的潛在表觀遺傳生物標記物。
研究思路:
（1） 採用oxBS-Seq方法繪製從健康宮頸到CIN到CC樣本在單鹼基解析度下的全基因組5mC/5hmC圖譜。
（2） 分析CC進展過程中差異甲基化區域（DMR）和差異羥甲基化區域（DhMR）變化趨勢。
（3） GO/KEGG富集分析與DMRs相關基因 （DAGs） 和DhMRs相關基因 （DhAGs）。
（4） 個性化分析DAGs和DhAGs甲基化和羥甲基化水平與基因表達的關係。
（5） 多組學綜合分析甲基化/羥甲基化與基因組變異的相關性
（6） 對甲基化/羥甲基化與組蛋白修飾關聯分析
研究結果:
(1)從健康人群到CC，全基因組5mC和5hmC水平呈下降趨勢
研究人員對2個健康宮頸組織、6個CIN組織（CIN1、CIN2、CIN3，n=2）、4對CC組織及對應的癌旁組織共16個樣本中提取DNA進行WGBS-seq和oxWGBS-seq測序（oxBS-seq），共480-1480萬個CpG位點可用於評估在鹼基解析度下的羥甲基化變化。在此基礎上，研究人員在單鹼基解析度下繪製了從健康宮頸到CIN到CC樣本的全基因組5mC/5hmC圖譜，並繪製了CpG位點的5mC/5hmC修飾圖譜。
結果顯示， 16個樣本中，從健康宮頸到CC，5mC和5hmC水平均呈下降趨勢（圖1A）；且所有患者的5hmC水平比5mC水平低43倍（圖1B）； 5mC修飾位點中有6。33%-24。63%的5hmC修飾，而健康宮頸中約有10%的5hmC修飾（圖1C，藍色標記），100%的5hmC修飾位點也同時被5mC修飾（圖1C，黃色標記）。
圖1
(2)5mC和5hmC含量分佈
研究人員分析了5mC和5hmC修飾位點在各基因組區域的分佈，結果顯示，CC與對應的癌旁癌旁組織的整體甲基化水平相似，整體高於健康組織和CIN組織，而癌旁組織的整體羥甲基化水平高於CC組織（圖2A）。
在CC中觀察到整體低甲基化和低羥甲基化，特別是與健康組織相比，CC中差異甲基化區域（DMR）和差異羥甲基化區域（DhMR）數量增加。在CIN和CC組織中，甲基化和羥甲基化水平變化主要發生在CpG島和 CpG周圍區域，且在CIN和CC中觀察到外顯子甲基化（圖 2B）。結果表明區域性甲基化/羥甲基化變化可能極大促進宮頸癌發生。
圖2
(3)CC發展過程中DMR和DhMR變化
與CIN1和CIN2相比，在CIN3和CC期DMR的數量增加，表明在CC發生過程中甲基化水平發生了變化。在CIN3期DhMR數量急劇增加，在CC期減少（圖3A）。從DMRs和DhMRs在CC中的分佈來看，CIN3發生高羥甲基化，CC發生低羥甲基化（圖3B），表明在CC發展過程中表現了劇烈的去甲基化轉變（圖3B）。
圖3
(4)與DMR和DhMR的相關基因
由於啟動子甲基化主要促成基因表達，研究人員重點關注啟動子區域的DMRs相關基因 （DAGs） 或 DhMRs相關基因 （DhAGs），發現有幾個甲基化基因（如NFIX、CDH4、PDE4D、PITX2和G6PD）（圖4A左）和兩個羥甲基化基因（PLSCR4、CUL4B）（圖 4A右）可能與CC的發生發展有密切關係。
為了深入瞭解甲基化和羥甲基化的潛在生物學功能，透過GO和KEGG富集了DAGs和DhAGs。GO富集結果提示了與CIN和CC相關的生物過程（圖4B）。KEGG富集結果顯示，這些甲基化基因在Hippo、cAMP、Adherens連線、軸突導向和神經活性配體-受體相互作用中顯著富集（均p<0。05）；羥甲基化基因也在Hippo、cAMP、Rap1、ErbB和MAPK訊號通路中顯著富集（圖4C）（均p<0。05）。
圖4
(5)DAGs和DhAGs甲基化和羥甲基化水平與基因表達的關係
將TCGA資料庫中CC甲基化資料和成對RNA-seq資料進行分析對比，發現結果是一致的。
甲基化/羥甲基化水平與基因表達之間的關係：
（1）啟動子區域的甲基化水平與基因表達呈負相關（圖5A）；
（2）啟動子邊界的上調基因表達中觀察到更高水平的甲基化；
（3）外顯子邊界的甲基化水平和基因表達之間呈正相關趨勢；
（4）羥甲基化，則沒有類似現象。
DAGs/DhAGs的甲基化或基因表達與總生存率之間的關係：
（1）MTIF2、PIP5K1A和RPS6KA6的甲基化和表達均與在CC總生存率呈正相關；
（2）DES和MAL的甲基化和表達與CC總生存率呈負相關（均p＜0。05 圖5B和5C）；
（3）ANGEL2、MPP1和PAPSS2的甲基化和表達不同，CC總生存率有顯著差異。
因此這8個基因的甲基化水平可以作為預測CC預後的潛在生物標誌。
圖5
(6)甲基化/羥甲基化與基因組變異的多組學綜合分析
作者比較了甲基化區域和基因複製數變異（copy number variations，CNVs）區域不匹配資料的位置，分析結果顯示，SCNV擴增或缺失區域與全基因組DMR區域呈現不一致地重疊（圖6A和6B）。比如CNV和DMR/DhMR在2號染色體上的位置不一致（圖6C）。
經多組學綜合分析驗證，證實在CINs和CC中，CNV與甲基化/羥甲基化之間無明顯相關性（圖6D）。甲基化/羥甲基化的發生遠早於CNV（圖6A和6B），即宮頸癌變診斷中表觀遺傳改變比遺傳改變發生得更早，這也表明甲基化/羥甲基化更適合作為CC早期預警標記。
圖6
(7)甲基化/羥甲基化與組蛋白修飾的關聯分析
最後，作者對甲基化和羥甲基化與組蛋白修飾相關聯分析，將甲基化/羥甲基化水平對映到來自encode資料庫健康宮頸中6個ChIP-Seq資料集訊號，分析結果顯示，啟動子和增強子區域相關的組蛋白修飾分佈和DNA甲基化有關（圖7）。
易基因小結
在這項研究中，研究人員納入從健康宮頸組織、CIN病變組織、 CC組織及癌旁組織等一系列樣本，以單鹼基解析度進行了全基因組DNA甲基化和羥甲基化圖譜分析。透過多組學分析證實了甲基化/羥甲基化與宮頸癌發生中的 CNV 無關，且甲基化/羥甲基化的發生遠早於CNV。確定了八個預後相關基因，可以作為CC治療的新靶點，這為表觀遺傳學在腫瘤發生和進展中的篩查診斷及預後提供了重要資料支援。
oxBS-seq檢測技術，透過化學氧化結合重亞硫酸鹽處理首先將5hmC氧化為5fC，進而可被重亞硫酸鹽轉換成U，從而排除了5hmC對5mC的訊號干擾，達到精確檢測基因組5mC的目的，具有實驗資料優質、多組學分析資料精準等優勢。